药物递送载体表征
传统的纳米药物递送载体的结构和形态表征手段主要是动态光散射（DLS）等一些间接表征手段，通常只能提供粒子的尺寸和分布信息，且统计得到的是液体动力学直径。传统的负染色电镜虽然可以直观地观察到纳米载体的形态、大小和结构特征，但由于染色和真空脱水，得到的结果与溶液状态也有所偏差。而冷冻电镜则避免了染色，可以直接观察样品在天然状态下的形态，且可以得到样品内部的信息，尤其是样品空壳率，mRNA在LNP复合物中的定位，具有独特优势。
主要优势
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样品需求量少 （30 μL, 1 mg/mL质量浓度）
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样品无需预处理
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检测所需时间短 （最快当天得到结果）
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得到真实的形态信息 （尤其是内部信息）
形态观察
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载药脂质体
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mRNA-LNP
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外泌体
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AAV
常见药物递送载体的冷冻电镜形貌表征
基于深度学习的颗粒提取和粒径分布统计
我们使用Thermo Science Amira软件对采集到的冷冻电镜照片进行基于深度学习的图像分割。在分割后的图像中通过计算其所占像素点的个数，算出每个颗粒的面积并换算成等效直径，得到粒径分布统计，同时可以计算得到颗粒长宽比以及表面粗糙度。一般进行此类分析，我们通常收集约30张电镜照片，统计样本大约2000个颗粒。
药物递送载体的粒径分布统计
膜厚度分析
针对膜载药的脂质体类样品，膜厚度是一个重要的统计参数，对于载药后膜形态的变化具有重要的研究意义。我们在颗粒识别后，描绘出颗粒轮廓，然后以轮廓的形状向内收缩，可以计算得到每一层球壳的平均灰度，找到平均灰度的两个极值点之间的距离即为统计得到的膜厚度。
药物递送载体的粒径分布统计
空壳率统计
针对脂质类样品，在图像分割后我们可以计算颗粒内部的像素点平均灰度值，并据此对颗粒进行分类，得到空心和实心的颗粒数量比例。
脂质类样品空壳率统计
针对病毒型载体，由于病毒颗粒具有高度同一性，我们可以收集较多电镜照片，并使用单颗粒分析方法，进行较大样本量的分析，通常可达到数百张照片，十万个颗粒样本。通过自动化数据处理，我们可以对颗粒进行二维分类或三维分类，得到空心和实心颗粒的平均图像及数量比例。
AAV样品空壳率统计
mRNA染色定位
无定形的mRNA较为松散，在电镜结果中衬度较差，难以识别，需要额外的染色操作才能定位。劳氏紫的染色原理基于其分子结构中的活性基团与细胞核中的核酸发生相互作用。劳氏紫分子中的芳香环和杂环结构使其能够与DNA和RNA中的碱基对发生π-π堆积作用，从而结合到核酸分子上。此外，劳氏紫中的氯原子和胺基可以与核酸分子中的负电荷相互作用，增强了染料与核酸的结合力。在电镜层面上看，劳氏紫的作用使mRNA密度更加致密，使电镜衬度增强。
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染色前
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染色后
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染色前
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染色后
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LNP样品中mRNA的染色定位
三维断层扫描重构
由于普通的冷冻电镜照片得到的是样品颗粒的二维投影，对于内部结构较为复杂的多层囊泡脂质体，得到的内部结构信息较为有限。我们可以采用三维断层扫描重构，在三维尺度上对样品进行重构和分析，得到更多的内部结构信息。
多囊脂质体冷冻电镜断层扫描重构
常见问题
Q
测样周期通常是多久？
A
收到样品当天进行冷冻制样，排到冷冻电镜机时后当天可得到观察结果，统计分析结果需要额外2~3天。若送样前提前预约机时，可以缩短排队等待的时间。
Q
待测样品有什么要求？
A
一般要求总脂质浓度大于1 mg/mL, 同时蔗糖含量尽量低，一般不超过10%。
Q
冻干粉样品可以观察吗？
A
可以的，冻干粉样品中蔗糖含量较高或复溶后样品浓度较低，一般需要复溶后透析或浓缩。
Q
冷冻电镜表征药物递送载体有什么优势？
A
可以直观地得到样品的图像信息，尤其是内部结构信息。冷冻制样保持了样品本身天然形态，得到真实粒径的分布。
Q
DLS和冷冻电镜得到的结果一致吗？
A
由于DLS得到的是液体动力学直径，冷冻电镜得到的是颗粒的真实粒径，DLS的结果可能会略微偏大，但总体分布趋势一致。
Q
听说冷冻电镜可以解析到3埃分辨率，那么在电镜照片上可以直接观察到LNP样品中的mRNA分子吗？
A
我们讲的分辨率一般指的是单颗粒分析，这种分析方法需要对数十万颗粒进行取向求解以及颗粒平均，要求颗粒具有同一性。而LNP中的mRNA并不具备这种同一性，每个mRNA分子的结构可能都不一致，所以无法进行颗粒对齐和平均。
