蛋白制备

佰翱得蛋白，结构生物学家的信赖之选

膜蛋白

膜蛋白在结构生物学领域面临着显著挑战，需要投入大量时间和金钱。然而，如果能迅速确定最适合的表达系统和纯化条件，并使用最少的资源获得膜蛋白，则可以大幅减少初始研究时间和财务负担，从而加速项目的早期阶段。

在佰翱得，我们开发了小规模工作流程，旨在促进膜蛋白的表达和纯化筛选。我们提供以下支持：快速克隆和小规模（每种条件3-5ml细胞培养）同时筛选构建体，使用多种表达系统，如大肠杆菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞培养。为加快筛选过程，我们采用常用的纯化标签（如His、FLAG、Twin-Strep、GST）和荧光报告蛋白（如eGFP、RFP、YFP、mStayGold），以快速识别最适合的表达和纯化条件。优化方案包括细胞培养时间、培养温度、溶剂成分、去垢剂选择、缓冲液pH值、盐浓度和其他添加剂等因素。

我们采用以下技术评估筛选过程的成功与否：荧光检测尺寸排阻色谱法（FSEC）、SDS-PAGE凝胶和Western Blot。针对膜蛋白极低表达水平的挑战，我们能够使用公司自售的抗eGFP纳米抗体填料，其具有高度特异性，可捕获eGFP标记的膜蛋白（解离常数Kd约为6 pM）。通过这种方法，我们已成功纯化了超过300种单独的膜蛋白，如G蛋白偶联受体（GPCR）、离子通道和转运蛋白。我们上线了很多膜蛋白进行售卖，有需要可以直接联系我们进行咨询。

Construct design

Gene/GFP

Homolog screening;

Protein engineering;

Affnity tags & vectors;

N/C terminal truncation;

Loop deletion;

Mutagenesis;

Fusion partners (T4L，BRIL...);

Expression system

Insent cell/Mammalian

Insect cell expression: System: Bac to Bac
Cell: sf9, Sf21 & Hi5

Mammalian cell expression:
System: Transient Transfection; BacMam
Cell: Expi293F, Expi293F GnTI-

Small scale expression test

  • Fluorescence microscope

    Rapid expression screening

    Sub-cellular localization in host cell

  • Fluorescence size exclusion chromatography (FSEC)

    High-throughput screening monodisperisty for constructs and solubilization conditions

    Estimation of MPs overexpression level

    No need for purification

    Less than 5 ml expression media

  • Western Blot

    Confirm the expression of intact MPs

Large scale expression and purification

  • Anti-eGFP nanobody-based affinity purification

    Catch the eGFP-tagged protein with high specificity

    Higher purity than the TALON/Streptactin resin

    Need to cleave the eGFP tag

  • Purified membrane protein

    Downstream application:
    Nanodisc reconstitution
    SPR assay;
    TRIC assay;
    Activity determination;
    Thermal shift assay
    Structure determination;

  • GPCRs

  • lon channels

  • SLCs

  • ABC transporters

  • Other MPs

我们的膜蛋白平台能够进行小规模的初步纯化，并为客户提供筛选更广泛条件的机会。这包括但不限于去垢剂、两性聚合物（Amphipols）组装、膜骨架蛋白（MSPs）组装、苯乙烯马来酸脂质颗粒（SMALPS）组装、脂类、pH值和盐分。

  • A2AR-nanodisc

  • ABC transporter X-SMALPs

  • ABCB10-Salipro

  • GlyRα3-amphipol

Quality control pipeline

  • Negative staining EM

  • LC-MS

  • Mass Photometry

在佰翱得，我们提供一系列生化和生物物理测定方法，以确保纯化的膜蛋白在后续应用中保持其功能完整性。具体来说，我们为ABC 转运体提供ATPase测定，以及热位移测定（Thermal Shift Assays）、表面等离子体共振（SPR，Surface Plasmon Resonance）和温度相关强度变化（TRIC，Temperature-Related Intensity Change）等生物物理测定。这些测定方法帮助评估膜蛋白的功能性和稳定性，从而确保其适合进一步的研究和应用。

ATPase assay for ABC transporters

ADP-Glo™assay

Phosphate detection assay

ATPase assay using 1mM ATP and purified ABC transporter in detergents

Biophysical assay-thermal shift assay

nanoDSF assay

CPM-based assay

Thermal shift assav usina purified ABC transporter in deteraents

Biophysical assay-SPR

SPR assay for A2AR

SPR assay for APJR

Biophysical assay-TRIC

TRlC( T emperature R elated I ntensity C hange)assay

Dianthus NT.23 Pico Duo

Compared to Traditional MST, TRIC:

Uses less protein

Allows more conditions (384wells)

Higher throughput

Done is as little as 30 min

Less background

在佰翱得，我们还专注于膜蛋白的冷冻电镜（Cryo-EM）研究。我们的专业知识涵盖多种类型的膜蛋白结构研究，包括非活性态G蛋白偶联受体（GPCRs）、活性态GPCRs、离子通道、溶质载体蛋白（SLCs）和ATP结合盒（ABC）转运体。通过将我们在Cryo-EM领域的专业知识与其他生物化学和生物物理测定方法相结合，我们可以全面揭示膜蛋白的结构和功能。这些信息对于理解膜蛋白在细胞过程中的作用以及开发靶向治疗药物至关重要。

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